Zginął 4 września 2006 r. około godziny 11 czasu lokalnego w wypadku na Wielkiej Rafie Koralowej w okolicach Port Douglas w stanie Queensland (Australia). Przyczyną śmierci było przebicie klatki piersiowej, a bezpośrednio serca ostrą końcówką ogona płaszczki w trakcie realizowania zdjęć pod wodą do filmu dokumentalnego. Jak podali zaprzyjaźnieni z Irwinem naukowcy, płynął on nad płaszczką, kiedy ta ugodziła go prosto w serce[2]. Irwin, wspólnie z Philippe'em Cousteau (wnukiem Jacques'a Cousteau), był w trakcie filmowania programu telewizyjnego na temat szkaradnic zatytułowanego "Najgroźniejsze stworzenia oceanu" (The Ocean's Deadliest), lecz w tym dniu pogoda nie pozwoliła na rozpoczęcie zdjęć. Irwin zdecydował się więc na sfilmowanie kilku "lżejszych" scen do programu dla dzieci, który przygotowywał wspólnie ze swoją córką Bindi. Irwin przypadkowo przepłynął zbyt blisko płaszczki, która poczuła się zagrożona i zaatakowała go, powodując jego natychmiastową śmierć[3]. W momencie jego śmierci rodzina Irwina przebywała na wakacjach na Tasmanii. Irwin jest trzecim Australijczykiem, który zginął w wyniku reakcji obronnej płaszczki[4], a na całym świecie odnotowano tylko 17 takich przypadków[5]. Jest to pierwszy znany przypadek uchwycenia takiego momentu na filmie.